01.光合成細菌RAP99のマクロファージ活性試験 | 専門家向け

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<マクロファージ細胞RAW267.4細胞に対するNO産生試験>

試験実施者:東北薬科大学(現:東北医科薬科大学)石川正明教授

【目的】

光合成細菌RAP99菌体の経口摂取、及び抗がん剤MMCあるいは5-FUを併用することにより、各々を単独で使用した場合と比較して腫瘍増殖抑制作用の増大、すなわち抗腫瘍作用が確認された。そこで、光合成細菌RAP99菌体の免疫活性化作用の指標として、マウスのマクロファージ細胞株RAW264.7細胞に対するNO(一酸化窒素)の産生作用について確認した。

【試料と方法】

(1)マクロファージ細胞及び培養条件

マウスのマクロファージ由来のRAW267.4細胞を、American Type Culture Collection(ATCC)から購入した。RAW267.4(4×106細胞/mL)をペニシリン(100単位/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)及び10%加熱不活性胎児牛血清(FBS)を含むRPMI1640培地(イワキ)で湿度95%、5%一酸化炭素濃度、37℃条件下で培養した。また、7日毎に継代維持した。

(2)試料の調整

光合成細菌RAP99の凍結乾燥粉体を滅菌したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁して、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3そして1 μg/mLの各濃度に試料溶液を調整した。

(3)NOの測定

細胞を96ウェルプレートに4×103細胞濃度で播種し、10%FBSを含むRPMI1640培地で24時間培養した。細胞に種々の濃度の試料を添加して、さらに24時間培養した。上清液50μLに、Griess試薬(0.5%スルファニルアミド、2.5%リン酸、0.05%ナフチルエチレンジアミン)50μLと混和した後、分光光度計(microplate reader)540nmの波長で吸光度を測定して行なった。

光合成細菌RAP99菌試料溶液によるNOの産生作用

図1 光合成細菌RAP99菌試料溶液によるNOの産生作用

【結果及び考察】

RAW267.4細胞において、光合成細菌RAP99菌体試料を添加して24時間培養したときに、用量依存的なNOの産生が観察された。これにより、光合成細菌RAP99菌体の抗腫瘍作用は宿主の免疫反応を介していることが示唆された。

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