18.光合成細菌RAP99のTLR活性試験 | 一般向け

<HEK293細胞を用いたTLR活性化確認試験>

試験責任者:自然免疫応用技研株式会社

 

【TLRとは?】

TLRは、トル様受容体(Toll Like Receptor)といい、細菌やウイルスなどの外敵の侵入を感知するセンサーの働きをしている。自然免疫系の細胞が持っており、ヒトでは現在10種類(TLR1~TLR10)が確認されている。それぞれが異なる病原体を認識して活性化し、獲得免疫へと誘導される。

【試験の目的】

光合成細菌RAP99(以下RAP99)およびRAP99由来LPS(以下RAP99-LPS)によるTLRの活性化について、HEK293細胞※1を用いて明らかにする。

※1:ヒト胎児の腎臓由来の細胞株のこと。これにTLR遺伝子を導入させたものを試験に用いた。TLRが活性化されるとIL-8※2が産生されるように設計されている。

※2:細胞間の相互作用に関与する物質であり、自然免疫系の重要な役割を担っている。

【試験結果】

各TLR遺伝子を導入したHEK細胞(①TLR導入なし、②TLR4、③TLR2、④TLR9、⑤TLR4/MD2/CD14※3)を用いてTLR活性試験を行った。TLRが活性化されるとIL-8が産生されるため、IL-8の濃度が高いほどTLRが活性化されていることを示す。陰性対照物質は培養液(medium)、陽性対照物質は乳酸菌死菌、または小麦やサツマイモなどの植物と共生している細菌より精製したLPS(以下、LPSp)を用いた。結果を以下に示す。

※3:TLR4にMD2やCD14といった補助因子を結合させたもの。TLR4は単体で用いるよりも、MD2やCD14と結合することで機能を発揮するといわれている。よって、TLR4活性試験はTLR4単体と、TLR4にMD2およびCD14を結合したTLR4/MD2/CD14の2種類を行った。

①TLR導入なしHEK細胞

図1にTLR導入なしHEK細胞におけるIL-8産生結果を示す。この結果、全てにおいてIL-8の誘導は認められなかった。

図1 TLR導入なしHEK細胞におけるIL-8産生結果

②TLR4導入HEK細胞

図2にTLR4導入HEK細胞におけるIL-8産生結果を示す。この結果、陽性対照物質のLPSpではIL-8が産生されたと考えられるが、その他の試料ではバラつきが大きく、有意な値ではないと考えられる。

図2 TLR4導入HEK細胞におけるIL-8産生結果

③TLR2導入HEK細胞

図3にTLR2導入HEK細胞におけるIL-8産生結果を示す。この結果、RAP99熱水抽出物とRAP99粉砕懸濁液では、陽性対照物質の乳酸菌死菌と同様に用量依存的なIL-8の誘導が認められた。よって、RAP99熱水抽出物およびRAP99粉砕懸濁液はTLR2を活性化させる働きがあることが推測された。また、RAP99-LPSについては、IL-8の誘導は認められなかった。

図3  TLR2導入HEK細胞におけるIL-8産生結果

 

④TLR9導入HEK細胞

図4にTLR9導入HEK細胞におけるIL-8産生結果を示す。この結果、RAP99熱水抽出物とRAP99粉砕懸濁液では、用量依存的なIL-8の誘導が認められた。よって、これらはTLR9を活性化させる働きがあることが推測された。また、RAP99-LPSについては、IL-8の誘導は認められなかった。

図4  TLR9導入HEK細胞におけるIL-8産生結果

⑤TLR4/MD2/CD14導入HEK細胞

図5にTLR4/MD2/CD14導入HEK細胞におけるIL-8産生結果を示す。この結果、いずれの試料からもIL-8の産生が認められ、特に陽性対照物質のLPSpとRAP99-LPSは低用量からIL-8の産生が認められた。よって、RAP99-LPS、RAP99熱水抽出物およびRAP99粉砕混濁液のいずれにおいてもTLR4を活性化させる働きがあることが推測された。

TLR4を単体で用いた場合には、IL-8の産生は有意なものとして認められなかったので(図2参照)、TLR4を活性化させるためには補助因子であるMD2とCD14が必要であると考えられる。

図5   TLR4/MD2/CD14導入HEK細胞におけるIL-8産生結果

【結果まとめ・考察】

表1に結果のまとめを示す。+は活性化、-は反応なし、±はどちらともいえないことを示す。

表1 RAP99のTLR活性試験結果まとめ

以上の結果から、RAP99-LPSは、TLR4を活性化させることが明らかになった。ただし、TLR4単体では有意な結果が得られなかったことから、TLR4を活性化させるためには、補助因子であるMD2およびCD14が必要であることがわかった。また、RAP99熱水抽出物およびRAP99粉砕懸濁液については、TLR2、4および9のいずれも活性化させると考えられる。

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