21.光合成細菌 RAP99-LPS のLPS耐性細胞RAW 264.7におけるNO産生試験 | 専門

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<光合成細菌 RAP99-LPSのLPS耐性細胞RAW 264.7におけるNO産生試験>

試験実施者:東北薬科大学 石川正明教授

【目的】

大腸菌由来のLPS(以下、大腸菌LPSと表記)による疾患に対する、RAP99-LPSの治療効果を検討するためにLPSの交差耐性を検討した。

【試料と方法】

1.RAW 264.7 細胞の調整

マウスマクロファージ細胞のRAW 264.7 細胞を96穴plate に2×105 cell/wellに調整後播種し、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むRPM11640培地で12時間インキュペートした。

2.LPS耐性細胞の調整

(1)大腸菌LPS

RAW264.7細胞の培地を、大腸菌LPSを0.01μg/mL 添加したものに交換して19時間培養後、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄して大腸菌LPS耐性細胞を調整した。

(2)RAP99-LPS

RAP99-LPS耐性細胞の培地を、RAP99-LPS を0.1、 1あるいは 10μg/mL 添加したものに交換して19時間培養し、PBSで洗浄して作成した。

3.2種のLPS耐性細胞の比較

大腸菌LPS 0.1あるいはRAP99-LPS 10μg/mL処置24時間後のNO産生量をLPS非耐性細胞の結果と比較検討した。

遊離したNO量は上清50μLにグリース試薬(2.5% スルファニルアミド、2.5% リン酸、0.05% N-(1-ナフチル)エチレンジアミン)を50μL添加し、540nmにおける吸光度をマイクロウェルプレート測定用全自動比色計イムノミニNJ-2300(バイオテック社製)を用いて測定した。得られたNO測定値を下記の計算式でNO産生抑制率(%)を計算した。

NO産生抑制率(%)=(LPS耐性細胞のNO産生量/LPS非耐性細胞のNO産生量)×100

【結果と考察】

1.大腸菌LPS耐性細胞

LPS非耐性細胞では大腸菌LPS 0.1μg/mLは93.2μM、RAP99-LPSの LPS10μg/mLは 75.3μMのNO産生が観察された。

LPS耐性細胞では大腸菌LPS は66.6μM(70.9%)、RAP99-LPSは 50.8μM(67.7%)のNO産生が観察され、RAP99-LPSには交差耐性が観察された。

2.RAP99-LPS耐性細胞

前項で述べた通り、LPS非耐性細胞では、RAP99-LPS 10μg/mLは75.3μM, 大腸菌由来のLPS 0.1μg/mLは93.2μMのNO産生が観察された。

RAP99-LPSの 0.1、1あるいは10g/mL耐性細胞では、RAP99-LPS 10μg/mLにより 50.8 (67.4%)、40.9 (54.3%)あるいは 44.0μM (58.4%)のNO産生が観察された。

RAP99-LPSの 0.1、1あるいは10g/mL耐性細胞では、大腸菌のLPS 0.1μg/mLにより 66.6 (71.4%)、55.2 (59.2%)あるいは 44.0 (47.2%)μMのNO産生が観察された。

RAP99-LPS耐性細胞では、RAP99-LPS及び大腸菌LPSに交差耐性が観察された。これにより、RAP99-LPSと 大腸菌LPS間で交差耐性が観察されたことから、病原性の低いRAP99-LPSにおいては、 大腸菌LPSによる疾患の予防、軽減効果が示唆された。

以上

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